BH4 ialah kofaktor aktif utama. Sintesis BH4 berlaku melalui dua laluan utama; laluan de novo melibatkan tiga langkah enzim, dan diteruskan daripada GTP, manakala laluan penyelamat menukar sepiapterin kepada BH4 menggunakan dihidrofolat reduktase.[4] Di samping itu, BH2 dikitar semula kepada BH4 oleh dihidrobiopterin reduktase.

Dalam laluan de novo, GTP ditukar kepada 7,8-dihydro neopterin trifosfat oleh GTP siklohidrolase I (GTPCH-1, FolE) yang mengembangkan cincin imidazola dalam GTP dengan satu karbon. Perantara ditukar kepada 6-piruvoil-5,6,7,8-tetrahydropterin oleh 6-piruvoiltetrahidropterin sintase, yang mengeluarkan fosfat, dan menghasilkan pengganti diketon (piruvoil). Langkah akhir dibantu oleh sepiapterin reduktase.[5]