Pada masa hadapan, pakar pensenjataan James McCullen (Christopher Eccleston) telah mencipta senjata berasaskan nanoteknologi; yang berupaya untuk menghancurkan sebuah bandaraya. McCullen mempunyai syarikat yang bernama M.A.R.S ( Military Armaments Research Syndicate ) ataupun 'Sindiket Penyelidikan Senjata Ketenteraan' dan telah menjual empat kepala peledak kepada NATO. Tentera NATO diketuai oleh Duke (Channing Tatum) dan Ripcord (Marlon Wayans) telah ditugaskan untuk menghantar kepala peledak ke tempat yang dituju. Semasa operasi, konvoi mereka telah diserang oleh kumpulan yang tidak dikenali namun yang mengejutkan ialah mereka diketuai oleh Baroness (Sienna Miller); di mana merupakan bekas tunang kepada Duke. Baroness cuba untuk merampas kepala peledak namun usaha mereka gagal kerana dihalang oleh askar G.I.Joe; Scarlett (Rachel Nichols), Snake Eyes (Ray Park), Breaker (Saïd Taghmaoui),dan Heavy Duty (Adewale Akinnuoye-Agbaje).