Mott dilahirkan pada 25 Mei 1865 di Livingston Manor, New York, Amerika Syarikat. Ketika berusia 2 tahun, bapanya, John Stitt Moot dan semua ahli keluarganya berpindah ke Postville, Iowa. Beliau mula menyertai Gereja Methodist pada usia 13 tahun. Pada tahun 1881, Mott belajar di Upper Iowa University. Selepas itu, Mott melanjutkan pengajiannya di Universiti Cornell, dan di sinilah beliau memulakan tugas misinya. Di universiti yang sama, Mott dipilih sebagai naib pengerusi "YMCA". Selepas menamatkan pengajian dari Cornell, beliau menjadi setiausaha "Persatuan Pelajar Kristian" di Amerika Syarikat dan Kanada. Beliau melawat semua universiti dan kolej di kedua-dua negara. Mott dikenali sebagai tokoh ekumenikal dunia kerana menyumbang kepada pembentukan "Pertubuhan Gereja Sedunia."

Selepas melawat Eropah dan mempromosikan ecumenisme, Mott mengembara ke Asia di mana, dari Oktober 1912 hingga Mei 1913, beliau mengadakan siri 18 persidangan serantau dan kebangsaan, termasuk di Ceylon, India, Burma, Malaya, China, Korea dan Jepun.[2]