Ružička dilahirkan di Vukovar, Croatia, kemudian menjadi sebahagian Kerajaan Kingdom-Slavonia, Kerajaan Hungary, Empayar Austro-Hungary. Keluarganya ialah tukang dan petani kebanyakannya dari asal-usul Croat, dengan seorang datuk bandar Czech, Ružička, dan moyang dari Austria.

Ružička menghadiri kelas sekolah menengah di Osijek. Beliau mengubah idea asalnya menjadi seorang imam dan beralih untuk mempelajari disiplin teknikal. Kimia ialah pilihannya, mungkin kerana beliau berharap untuk mendapatkan jawatan di kilang penaik gula yang baru dibuka di Osijek.

Akibat kesukaran yang berlebihan dalam kehidupan seharian dan politik, beliau pergi dan memilih Sekolah Teknik Tinggi di Karlsruhe di Jerman. Beliau ialah seorang pelajar yang baik di bidang yang disukainnya dan bahawa berfikir akan diperlukan dan bermanfaat pada masa depan, iaitu kimia organik. Itulah sebabnya profesor kimia fizikalnya, Fritz Haber (pemenag Nobel pada tahun 1918), menentang sarjana cummaude beliau. Walau bagaimanapun, semasa pengajiannya, Ružička mengadakan kerjasama yang sangat baik dengan Hermann Staudinger (seorang pemenang Hadiah Nobel pada tahun 1953). Belajar di jabatan Staudinger, beliau memperoleh ijazah kedoktorannya pada tahun 1910, kemudian berpindah ke Zurich sebagai pembantu Staudinger.