Dua tahun selepas Pertempuran New York,[4] Steve Rogers bekerja di Washington D.C. untuk S.H.I.E.L.D. dibawah pimpinan Nick Fury sambil menyesuaikan diri dengan masyarakat kontemporari. Rogers dan Ejen Natasha Romanoff dihantar bersama pasukan memerangi keganasan S.H.I.E.L.D., S.T.R.I.K.E., diketuai Ejen Rumlow untuk membebaskan tebusan di atas kapal S.H.I.E.L.D. dari Georges Batroc dan tentera upahannya. Semasa pertengahan misi, Rogers mendapati agenda lain Romanoff: untuk mengekstrak data dari komputer kapal kepada Fury. Rogers kembali ke Triskelion, ibu pejabat S.H.I.E.L.D., untuk berhadapan dengan Fury dan diberi taklimat mengenai Projek Insight: tiga Helicarrier dikaitkan dengan satelit pengintip, direka untuk menghapuskan ancaman. Tidak dapat menyahsulit data yang diambil oleh Romanoff, Fury berasa sangsi mengenai Insight dan menyuruh pegawai senior S.H.I.E.L.D., Alexander Pierce untuk melewatkan projek itu.

Dalam perjalanan untuk berjumpa dengan Maria Hill, Fury diserang hendap oleh penyerang yang diketuai oleh seorang pembunuh misteri yang dikenali sebagai Winter Soldier. Fury melepaskan diri ke apartmen Rogers dan memberi amaran kepada Rogers bahawa S.H.I.E.L.D. dikompromi. Selepas memberi Rogers satu pemacu kilat mengandungi data dari kapal, Fury ditembak oleh Winter Soldier. Fury mati ketika pembedahan dan Hill mengambil badannya. Pada hari berikutnya, Pierce mengarahkan Rogers ke Triskelion. Apabila Rogers engan memberi maklumat Fury, Pierce menamakannya sebagai pelarian. Diburu oleh S.T.R.I.K.E., Rogers berjumpa Romanoff. Menggunakan data dalam pemacu kilat, mereka menemui bunker rahsia S.H.I.E.L.D. di New Jersey, dimana mereka mengaktifkan superkomputer mengandungi Arnim Zola. Zola mendedahkan bahawa sejak S.H.I.E.L.D. ditubuhkan selepas Perang Dunia Kedua, Hydra telah beroperasi secara rahsia di dalam jajarannya, menyemai huru-hara global dengan matlamat bahawa manusia dengan relanya menyerahkan kebebasan sebagai pertukaran untuk keselamatan. Pasangan itu berjaya mengelakkan kematian apabila peluru berpandu S.H.I.E.L.D. memusnahkan bunker itu dan menyedari bahawa Pierce ialah ketua Hydra dalam S.H.I.E.L.D.

Rogers dan Romanoff mendapatkan bantuan bekas para penyelamat USAF, Sam Wilson yang merupakan kawan Rogers dan memperoleh pek sayap berkuasa "Falcon". Menyimpulkan bahawa ejen S.H.I.E.L.D., Jasper Sitwell merupakan ejen Hydra, mereka memaksanya mendedahkan bahawa Zola membangunkan algoritma perlombongan data yang boleh mengenal pasti individu yang mungkin menjadi ancaman kepada masa depan rancangan Hydra. Helicarrier menggunakan senjata satelit berpandu untuk menghapuskan individu-individu ini. Rogers, Romanoff dan Wilson diserang hendap Winter Soldier, yang membunuh Sitwell. Semasa berlawan, Rogers mengenali Winter Soldier sebagai Bucky Barnes, kawannya yang ditangkap dan dieksperimen ketika Perang Dunia Kedua. Hill berjaya mendapatkan ketiga-tiga mereka ke rumah yang selamat di mana Fury, yang memalsukan kematiannya sedang menunggu dengan rancangan untuk mensabotaj Helicarrier dengan menggantikan cip pengawal.

Selepas ahli Majlis Keselamatan Dunia tiba untuk pelancaran Helicarrier, Rogers menyiarkan plot Hydra untuk semua orang di Triskelion. Romanoff yang menyamar sebagai salah seorang ahli Majlis melucutkan senjata Pierce. Fury tiba dan memaksa Pierce untuk membuka kunci pangkalan data S.H.I.E.L.D supaya Romanoff boleh membocorkan maklumat sulit untuk mendedahkan Hydra kepada orang ramai. Selepas pergelutan, Fury membunuh Pierce. Sementara itu, Rogers dan Wilson memasuki dua Helicarrier dan menggantikan cip pengawal mereka tetapi Winter Soldier memusnahkan sut Wilson dan berlawan Rogers. Rogers berjaya meletakkan cip terakhir, membenarkan Hill untuk mengawal dan memusnahkan kapal itu satu sama lain. Rogers enggan melawan Winter Soldier dalam percubaan untuk mencapai kawannya, tetapi ketika kapal itu berlanggar dengan Triskelion, Rogers ditolak jatuh ke dalam Sungai Potomac. Winter Soldier menyelamatkan Rogers yang tidak sedar sebelum menghilangkan diri ke dalam hutan. Dengan S.H.I.E.L.D. yang kucar kacir, Romanoff hadir di hadapan jawatankuasa kecil Senat dan Fury pergi ke Eropah Timur untuk mengejar baki sel Hydra. Rogers dan Wilson memutuskan untuk mencari Winter Soldier, manakala Rumlow, yang merupakan ejen untuk Hydra, dimasukkan ke hospital selepas kemusnahan Triskelion.

Dalam babak pertengahan kredit, Baron Wolfgang von Strucker, di makmal Hydra mengisytiharkan bahawa "masa keajaiban" telah bermula dan saintis memeriksa sebuah tongkat tenaga penuh[N 1] dan dua tahanan: satu dengan kuasa kelajuan luar biasa, satu lagi dengan kuasa telekinetik. Dalam babak pasca kredit, Winter Soldier melawat memorial Bucky di Institusi Smithsonian.