Pada usia 71 tahun, Defensor Santiago meninggal dunia pada jam 8:52 pagi pada 29 September 2016 ketika beliau berada di Pusat Perubatan St Luke di Taguig dari kanser paru-paru; beberapa laporan menyebut bahawa Defensor Santiago meninggal di kediamannya di La Vista Subdivision, Quezon City.[23][24][25] Jasadnya terletak di Katedral Grottos Katedral Immaculate Conception di Cubao pada keesokan harinya.[26] Berikutan Massa pengebumian Katolik, mendiang dikebumikan di Taman Memorial Loyola di Marikina pada 2 Oktober, di samping makam anaknya, Alexander, yang meninggal dunia pada tahun 2003.[27][28][29]