Bahasa yang paling meluas dipertuturkan di Lembangan Amazon ialah bahasa Portugis, iaitu bahasa rasmi Brazil, diikuti rapat oleh bahasa Sepanyol, iaitu bahasa rasmi di negara-negara lain yang dilitupi lembangan ini. Di Brazil, bahasa Portugis menjadi bahasa pertuturan 98% penduduk, sementara di negara-negara berbahasa Sepanyol, wujudnya sebilangan besar penutur bahasa asli, namun bahasa Sepanyol tetap menguasai.

Terdapat ratusan bahasa pribumi yang masih dituturi di rantau Amazon, tetapi kebanyakan bahasa itu hanya digunakan oleh sebilangan kecil orang dan oleh itu hampir pupus. Salah satu bahasa pribumi yang luas digunakan di Amazon ialah bahasa Nheengatu, iatu pewaris bahasa Tupi yang pernah dituturi di kawasan pantai dan tengah Brazil. Ia dibawa ke lokasi masa kini di sepanjang Rio Negro oleh penjajah Brazil yang mengutamakan bahasa Tupi daripada bahasa rasmi Portugis untuk berhubungan sehingga pertengahan abad ke-17. Selain bahasa Nheengatu moden, turut terdapat bahasa-bahasa lain dalam rumpun Tupi yang digunakan di situ, di samping rumpun-rumpun bahasa pribumi yang lain seperti Jê, Arawak, Karib, Arawá, Yanomamo, Matsés dan lain-lain.