Walaupun struktur DNA ditakrifkan sebagai heliks ganda dua pada tahun 1953,[3] namun setelah puluhan tahun kemudian barulah dapat dianalisanya cebis-cebisan DNA untuk dijujukkan di makmal. Penjujukan RNA adalah antara bentuk penjujukan nukleotida yang terawal. Pencapaian utama penjujukan RNA sequencing ialah penjujukan gen lengkap yang pertama pada tahun 1972[4] serta genom lengkap Bakteriofaj MS2 yang dikenal pasti dan diterbitkan pada tahun 1976.[5] oleh Walter Fiers dan rakan-rakan sekerjanya di Universiti Ghent (Ghent, Belgium).

Antara pencapaian-pencapaian terpenting dalam penjujukan DNA terhasil pada 1970-an. Frederick Sanger mencipta kaedah-kaedah penjujukan DNA yang pantas di MRC Centre, Cambridge, UK serta menerbitkan satu kaedah untuk "menjujukkan DNA dengan perencat penamat rantai" pada tahun 1977.[6] Walter Gilbert dan Allan Maxam di Harvard turut mencipta kaedah-kaedah penjujukan, termasuklah satu untuk "menjujukkan DNA secara degradasi kimia".[7][8] Pada tahun 1973, Gilbert dan Maxam melaporkan jujukan 24 pasangan bes dengan menggunakan kaedah yang dikenali sebagai wandering-spot analysis (analisa titik merayau).[9] Kemajuan dalam penjujukan DNA dibantu oleh perkembangan teknologi DNA rekombinan yang seiring dengannya agar contoh-contoh DNA dapat diasingkan dari sumber-sumber selain dari virus.

Genom DNA lengkap pertama yang dijujukkan adalah milik bakteriofaj φX174 pada tahun 1977.[10] Para saintis Medical Research Council mentafsirkan jujukan DNA virus Epstein-Barr selengkapnya pada tahun 1984, mendapatinya sepanjang 170 ribu pasangan bes.

Makmal Leroy E. Hood di California Institute of Technology mengumumkan mesin penjujuk DNA separa automatik yang sulung pada tahun 1986.[11] Ini disusuli oleh pemasaran ABI 370, iaitu mesin penjujuk automatik sepenuhnya yang sulung oleh Applied Biosystems, pada tahun 1987. Pada 1990, Institut-institut Kesihatan Negara (NIH) AS memulakan percubaan menjujukkan Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, dan Saccharomyces cerevisiae secara besar-besaran pada kos US$0.75 sebes. Sementara itu, penjujukan cDNA manusia yang bergelar teg jujukan terungkap dimulakan di makmal Craig Venter dalam cubaan untuk menemui pecahan pengekod genom manusia.[12] Pada tahun 1995, Venter, Hamilton Smith, dan rakan-rakan sekerja di Institut Penyelidikan Genom (TIGR) menerbitkan genom lengkap pertama bagi organisma yang hidup bebas, iaitu bakteria Haemophilus influenzae. Kromosom berbentuk bulat ini mengandungi 1,830,137 bes, malah penyiarannya dalam jurnal Science[13] menandakan kali pertama diterbitkannya penjujukan shotgun seluruh genom untuk menidakkan perlunya untuk memetakan terlebih dahulu. Menjelang tahun 2001, kaedah penjujukan shotgun telah pun digunakan untuk menghasilkan draf jujukan genom manusia.[14][15]

Pada pertengahan hingga lewat 1990-an telah diciptanya beberapa kaedah penjujukan DNA "generasi baru". Pada tahun 1996, Pål Nyrén bersama anak didiknya Mostafa Ronaghi di Institut Teknologi Diraja Stockholm menerbitkan kaedah pyrosequencing.[16] Setahun kemudian, Pascal Mayer dan Laurent Farinelli menyerahkan paten-paten yang memerikan penjujukan koloni DNA kepada Pertubuhan Harta Intelek Sedunia.[17] Lynx Therapeutics menerbitkan dan memasarkan "Penjujukan selari besar-besaran" (Massively parallel signature sequencing, MPSS) pada tahun 2000. Kaedah ini menerapkan teknologi penjujukan berasaskan manik yang terselari dan terantara adapter/ligasi, dan berfungsi sebagai kaedah penjujukan "generasi baru" yang dikomersilkan, namun tidak satu pun penjujuk DNA yang dijual kepada makmal bebas.[18] Pada tahun 2004, 454 Life Sciences memasarkan satu versi pyrosequencing yang terselari.[19][20] Versi terawal bagi mesin mereka mengurangkan kos penjujukan sebanyak enam kali berbanding dengan penjujukan automatik Sanger, malah merupakan yang kedua dalam teknologi penjujukan generasi baru selepas MPSS.[21]

Kuantiti data banyak yang dihasilkan oleh penjujukan DNA juga telah memerlukan pembangunan kaedah dan atur cara baru untuk analisa jujukan. Phil Green dan Brent Ewing dari Universiti Washington menerangkan phred quality score untuk analisa data jujukan pada tahun 1998.[22]